通过外源转导Oct4等四个因子可将多种人类成体细胞去分化为诱导的多能干细胞(iPSCs)¨‘3】。研究证明Oct4在这四个因子中发挥关键和核心作用M】。通过激发细胞内源性Oct4的表达可能实现细胞的去分化，本研究以人表皮干细胞为模璎，发现6一氨基己酸对细胞内源性Oct4的诱导效应。
材料和方法
1 材料
包皮标本来自解放军总医院泌尿外科包皮环切术患者，无泌尿系统疾病感染，患者年龄18—30岁。所取包皮标本均得到患者知情同意；角质细胞基础培养基Epilife、角质细胞生长添加剂HKGs、胰酶／EDTA(TE)及胰酶／EDTA抑制剂(DTI)均购自Cascade Biologics公司(Oregon，SW)，双抗(PS)购自Invitrogen公司，Ⅳ型胶原购自Sigma公司，RT—PCR试剂盒购自Promega公司，6一氨基己酸(6-Aminohexanoic Acid)来自临床用药。根据已知Oct4基因序列设计上下游引物。上游引物：5，-CGTGAAGCTGGAGAAGGAGAAGCTG一3：下游引物：5’一CAA—GGGCCGCAGCTTACACATGTTC一3 7：B—actin基因上游引物：5'-AAAGACCTG—TACGC CAACAC一3：下捞宇弓l物：5’一GTCATACTCCTGCTT GCTGAT一3’。PCR引物合成由北京三博远志生物技术有限责任公司完成。
2试剂制备
1)表皮干培养基配制：500ml角质细胞基础培养基Epilife添加5ml角质细胞生长添加剂HKGs及5ml双抗(PS)，4℃保存备用。
2)中性蛋白酶配制：国产中性蛋白酶200mg，用D—hanks溶解定容至100ml，过滤除菌，分装后4℃保存备用。3)Ⅳ型胶原包被培养瓶及6孑L板的制备：IV型胶原溶于体积分数为0．1％的醋酸溶液至终浓度为100mg／L，过滤除菌，分装后一20℃保存备用。细胞贴壁培养前lh用配制好的Ⅳ型胶原溶液1-2ml平铺于25cm培养瓶中及6孔板内。
3）表皮干细胞的分离与培养无菌条件下去除皮下脂肪层，用含双抗(Ps)的PBS反复冲洗包皮数次，修剪为大小约lem×lcm皮片，中性蛋白酶4℃消化14—16h，吸弃上清，分离表皮和真皮层，剪碎表皮，0．25％胰酶／EDTA37 oC消化lh，加入含有10％小牛血清的DMEM终止消化，剧烈振荡后200目筛网研磨滤过，滤液经l 000r，5min收集细胞，弃上清，加入表皮干培养基并轻柔吹打制成单细胞悬液，接种于预先铺有Ⅳ型胶原的培养瓶及孔板内，37℃孵育lh，倒置显微镜下观察，黏附在Ⅳ型胶原被膜上的细胞则主要为表皮干细胞，吸除上清，加入表皮干培养基，置于37℃，5％C02孵箱培养，次日，吸除上清，PBS冲洗1次，加入表皮干培养基，置于37。C，5％CO：孵箱继续培养，每2d换液1次，光镜下观察细胞生长情况。
4 RT—PCR
表皮干细胞培养3—5d出现克隆性生长时，加入工作浓度为60斗M的6一氨基己酸，24h后再诱导1次，48h后提取表皮干细胞mRNA进行RT—PCR，以未诱导细胞作为对照。
4．1 Oct4基因的扩增
设计上下游引物，按照下列条件进行RT—PCR反应：95℃5min；95℃lmin，62℃45s，72℃80s，40个循环；72℃5min。PCR反应结束后，以DL2000作为对照，取8斗l PCR反应产物进行l％琼脂糖凝胶电泳分析。
4．2 p—actin基因的扩增
设计上下游引物，按照下列条件进行PCR反应：940C 5min；940C 40s，62't2 40s，72℃40s，33个循环；72℃lOmin。PCR 反应结束后，以DL2000作为对照，取8恤l PCR反应产物进行1％琼脂糖凝胶电泳分析。
结果
1 表皮干细胞的生物学特征筛选后贴壁的表皮干细胞于倒置显微镜下观察，细胞均匀分散、呈圆形、胞体小、折光性强；24h后细胞略伸展为卵圆形、三角形或眼状；3—5d后，有部分较小克隆状细胞形成，胞体紧密连接，核／浆比大，呈圆形、折光性强、复层生长。见图1、图2。
2 RT—PCR检测
表皮干细胞mRNA逆转录为cDNA后，常规PCR，PCR产物进行l％琼脂糖凝胶电泳后，出现247bp(Oct4)和219bp(B—actin)目的片段明亮的特异性条带。见图3、图4。
讨论
转导Oct一4、Sox2、KⅡ4及e—Mye四个基因可将多种人类成体细胞重编程为类似于胚胎干细胞(ESCs)的全能干细胞，该类干细胞称为iPS(inducedPluripotent Stem Cellsl细胞【2-61。iPS细胞的问世为再生医学及细胞移植治疗带来新的希望。但是由于转基因涉及的技术复杂、操作有一定难度、重编程率低以及外源性基因导入可能带来的安全性风险等问题尚未解决，因此，建立新一代的非转基因或限制性(尽量少转基因或不转基因)转基因的诱导方法，将对iPS研究带来新的曙光和挑战。最近，德国科学家仅通过转染1个基因(Oct4)并成功诱导形成iPS细胞的研究结果提示限制性或非转基因的方法可能诱导产生iPS细胞[7]。
6一氨基己酸(EACA)已被证实可抑制补体系统中Cl的激活但并不抑制已激活的C1【8J。有报道说通过荧光流式细胞计量术可检测到EACA能抑制纤溶酶原结合到被激活的血小板上【9】。EACA在体外还被用于抑制由外源性组织型纤维蛋白溶酶原激活剂在血液中引起的血块溶解现象1101。在一个有关培养鼠c6神经胶质瘤细胞的研究中，EACA能促进纤维蛋白溶酶从细胞中快速解离，这样就的体温、心率、呼吸、白细胞四项诊断指标缺乏特异性，现已增加了CRP、IL一6等炎症指标，作为实验室诊断SIRS的依据lSl。CRP是一种非常敏感的炎性反应标志物，其升高程度与炎症、组织损伤的程度呈正相关。相关研究表明，CRP升高得越明显，全身炎症反应越重，其危重程度越高，发生MODS几率越高。IL一6是敏感反映机体炎症和组织损伤严重程度的重要指标，主要由单核细胞在TNF一仅、IL一1等诱导下产生，是细胞因子网络中重要成分，可与TNF一仪等协同，构成炎症介质网络，催化和放大炎性反应以及毒性作用，造成细胞的损害。IL一6作为SIRS中重要因子，在炎症反应中起重要作用，动态监测IL一6水平对SIRS的发生发展有积极意义161。
VSD减轻全身炎症反应机制，我们认为，一是VSD持续的负压通畅引流，能及时充分地清除创面及引流腔隙的渗液，减少坏死组织等对机体的不良刺激，使炎症因子产生减少；二是VSD能减轻伤道周围组织水肿，从而减轻对微血管的压迫，改善局部血液循环、增加伤道周围组织血流量，从而减轻局部的创伤性炎症反应，使伤道周围受损组织的亚急性坏死减少，进而减少刺激机体产生炎症因子。
研究结果提示，清创后采用VSD处理伤口比用传统方法在减少机体的炎症反应方面具有明显的优势，能够改善严重多发伤的预后。由于目前缺乏类似的研究报道，所以仍需在今后的临床实践中进一步验证。
参考文献
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