日光中的长波紫外线(UVA)和中波紫外线(UVB)照射可对皮肤造成急性损伤(如13晒伤)、慢性累积性损伤(如光老化、皮肤癌)，对人类健康构成潜在危害。皮肤的急性光损伤主要为红斑反应，日光照射数小时后皮肤出现潮红、水肿，严重者伴有水泡、脱屑及发热、恶心等全身症状[1]。UVA和UVB对人的表皮均有损伤作用，但不同波长、不同强度的紫外线照射引起的皮肤急性损伤程度表现各有不同，细胞的形态结构、增殖及凋亡情况等改变也有区别。作为皮肤的最外层，角质形成细胞接受的紫外线照射最多，受到的光损伤也最为严重[2]。本研究对不同波长、不同剂量的紫外线造成的人表皮永生化角质形成细胞株(HaCaT细胞)损伤情况进行了比较，旨在探讨急性光损伤模型建立的条件，现报告如下。

材料与方法

一、细胞来源及主要仪器

      HaCaT细胞购自广州吉妮欧生物科技有限公司。紫外光源：UVB灯管，波长范围290～320nm，峰值297 nm，40 W，4只；UVA灯管，波长范围320～400 nm，峰值365 nm，40 W，4只，均为北京电光源研究所产品。

二、HaCaT细胞培养

      将HaCaT细胞接种于培养瓶中，加入含10％胎牛血清的培养基，在370C、5％CO：的培养箱中培养。当细胞长至90％融合时传代，分别将传代的HaCaT细胞，置于90 mnl培养皿中培养，内含青霉素100 U／rnl、链霉素100斗g／ml和10％小牛血清，适量DMEM培养液，2—3 d换液或0．25％胰酶消化传代。根据实验需要，细胞浓度通过含10％胎牛血清的培养基调整，定量接种于96孔板上，备用。

三、UVA／UVB照射HaCaT细胞

     光源与细胞的垂直照射距离为15 cm。将HaCaT细胞接种于培养板中，待细胞长至90％融合时，将其随机分为UVA照射组(2．5、5、10、20、40 J／cm2)、UVB照射组(11．4、22．8、34．2、57、79．8 rnJ／cm2)及非UVA／UVB照射组(0 mJ／em2)。照射完成后换为培养基继续培养。光学显微镜观察细胞经照射后的形态学变化。

四、HaCaT细胞增殖效应的检测

      HaCaT细胞经照射并孵育18 h后，将培养板移人CO：培养箱，继续培养细胞，24 h后每孔加入M1Yr溶液(5 mg／m1)20¨l，37℃孵育，4 h后吸弃孔内培养上清液。每孔加入150ul二甲亚砜，振荡10 min，使蓝色结晶物充分溶解，在酶标仪490 nm处测量各孔吸光度(OD值)。

五、HaCaT细胞凋亡率的检测

      当约90％的HacaT细胞融合时，在照射前弃去培养液，重新每孔中加入1 ml磷酸盐缓冲液后照射紫外线。经UVA或UVB照射并培养18 h后，用0．25％胰酶消化收集细胞，稀释成单细胞悬液，吸取细胞悬液离心5 min。然后用细胞刮匙收集、处理细胞，用4cC预冷的磷酸盐缓冲液洗涤细胞2次，250 pl结合缓冲液重新悬浮细胞，调节其细胞含量为1 X 106／ml，取100斗l的细胞悬液于5 ml流式管中，加入5 Ixl Annexin V／FITC和10斗I的碘化丙锭溶液(20斗∥m1)，混匀后于室温避光孵育15min，在反应管中加400斗l磷酸盐缓冲液，上流式细胞仪分析。

六、统计学处理

      使用SPSS 16．0软件处理数据。计量资料以x-±s表示，各剂量组与对照组间比较采用Dunnett-t检验；计数资料行，检验。以P<0．05为差异有统计学意义。

结果

一、形态学改变

      光学显微镜下可见，接受2．5～10 J／em2剂量UVA照射并培养18 h后的HaCaT细胞形态基本无改变；经20～40 J／em2剂量UVA照射后，HaCaT细胞肿胀，脱落，细胞碎屑增多，漂浮于培养基中。经57 mJ／em2剂量UVB照射并培养18 h后HaCaT细胞形态已出现轻度改变，随着UVB剂量的增加，细胞形态的改变越明显，见图1。

二、细胞增殖情况
     经2.5、5、10 J/cm'UVA照射的HaCaT 细胞OD值与空白对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)，经20、40 J/cm2'UVA 照射的HaCaT细胞OD值明显低于空白对照组(P<0.05); 经11.4、22.8、34. 2mJ/cm'UVB照射的HaCaT细胞OD值与空白对照组比较差异无统计学意义(P>0. 05),其余剂量(57、 79.8 mJ/cm2) 照射下HaCaT细胞OD值明显降低(P<0. 05)，见图2。

三、细胞凋亡情况
      经2.5、5、10 J/cm?UVA照射的HaCaT 细胞凋亡率与空白对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)，经20、40 J/cm'UVA照射的HaCaT细胞凋亡率明显升高(P<0.05)。经11.4、22.8、 34. 2mJ/cm2UVB照射的HaCaT细胞凋亡率与空白对照组比较差异无统计学意义(P>0. 05)，其余剂量(57、79.8 mJ/cm2) 照射下HaCaT细胞凋亡率明显升高(P<0.05)， 见图3。

讨论     

       过量紫外线照射对健康的危害已逐渐成为全球最为关注的重大环境与健康问题之一。紫外线照射可引起日晒伤、光老化、光敏性皮肤病和各种不同类型的皮肤癌等疾病[34]皮肤是直接抵御大自然中紫外线照射的重要器官[5]位于其最外层的角质形成细胞接受的紫外线照射最多，受到的光损伤也最严重。UVA和UVB均可对角质形成细胞造成损伤，UVA波长较长，达320 ~ 400mm,，可穿透真皮，在大剂量时才损伤角质形成细胞，UVB波长较短，为280 ~320 mm，但能量较高，主要作用于表皮，角质形成细胞是其靶细胞。在产生生物学效应方面，UVB致红斑的作用要比UVA强1 000倍，在较小剂量时即可对角质形成细胞造成损伤[6-7]。暴露部位的皮肤受紫外线照射后可产生活性氧簇或自由基而遭受严重的氧化损伤，导致细胞和亚细胞线粒体和DNA损伤，DNA复制错误、细胞膜受损、核苷酸辅酶破坏、含巯基酶失活、超氧化物歧化酶下降等，从而使皮肤组织和细胞老化，直至相应皮肤组织细胞凋亡，而皮肤组织细胞的调亡又使皮肤光老化反应加剧[8-10]。由于对紫外线照射造成的损伤的相关机制研究逐渐增多，如何构建合适的光损伤模型成为各实验的首要问题。

      本研究显示，当UVA及UVB达到一定的照射剂量时，HaCaT细胞形态发生变化，增殖活性下降，细胞凋亡率升高。由此证明，UVA及UVB均可构建急性光损伤模型，但由于HaCaT细胞对UVB的敏感性比较高，所以用UVB照射构建模型.时所需照射剂量较低，用UVA照射构建模型时所.需照射剂量较高。该实验结果与Bang等"1的研究.结果一致。

      在本实验中，当UVA剂量达到20 J/em2、UVB剂量达到57mJ/cm2时，角质形成细胞的增殖活性下降，细胞凋亡率升高，提示该剂量为引起HaCaT细胞急性光损伤的最低剂量,达到最低剂量后，随着剂量的逐渐增加，增殖活性逐渐下降，凋亡率逐渐升高，提示根据不同的实验要求可造出不同程度损伤的急性光损伤模型。

参考文献

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本文献转载于新医学2013年8月第44卷第8期，不代表本网站赞同其观点和对其真实性负责，我们用于阅读分享，非商业用途，如若侵权，请告知删除。