酪氨酸酶(ECI．14．18．1)又称多酚氧化酶，其活性中心含有金属铜离子，广泛存在于动植物体和人体内，是生物体合成黑色素等色素的关键酶。酪氨酸酶主要参与两个反应过程：催化L-酪氨酸羟基化转变为L一多巴(单酚氧化酶活性)和氧化L-多巴形成多巴醌(多酚氧化酶活性)，多巴醌经一系列中间体反应后形成黑色素[1. 2]。酪氨酸酶抑制剂就是通过抑制酪氨酸酶活性从而抑制黑色素生成的，因而可用于预防和治疗色素沉着和黑色素瘤等。将酪氨酸酶抑制剂作为化妆品添加剂用于美白、保护皮肤等，具有广阔的应用前景，随着化妆品工业“组份天然化”及“回归大自然”的潮流，植物源酪氨酸酶抑制剂的研究开发倍受重视[3]。
西藏红缨合耳菊(Synotis erythropappa(Bur．et Franch．)C．Jeffrey et Y．L Chen)为西藏特有的菊科 (Compositae)植物，产于西藏东南部，当地女性将其捣碎、烧成灰等后，敷在皮肤表面用于皮肤保养及紫外线防护。本实验通过研究西藏红缨合耳菊70％乙醇提取物及其石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取部分及水溶部分对酪氨酸酶的抑制作用，来探讨西藏红缨合耳菊美白皮肤的依据。
1 材料与仪器
西藏红缨合耳菊采自西藏波密县(经华南农业大学俞新华教授鉴定为西藏红缨合耳菊)；蘑菇酪氨酸酶、L-3，4一二羟基苯氨酸(L-DOPA)、L一酪氨酸为Sigma化学公司产品；熊果苷为上海奥利实业有限公司产品；电子天平(日本岛津，精密度0．0001g)；旋转蒸发仪(上海亚荣仪器有限公司)；PHS-25数显pH计(上海精密科学仪器有限公司)；UV-2450双光束紫外可见分光光度计(日本岛津)；其余试剂均为分析纯。
2 方法
2．1 西藏红缨合耳菊的提取分离
称取干燥的西藏红缨合耳菊100 g，常温下以70％乙醇浸泡14 d，每天震荡数次。过滤，滤渣用少量70％乙醇浸泡洗涤3次，合并滤液，减压浓缩后依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取得到极性不同的四部分，减压浓缩并真空干燥后得到各部分的浸膏，各浸膏用DMSO配成各浓度溶液备用。
2．2 酪氨酸酶活性抑制实验
参考Y．B．Ryu等H[4]及邓湘庆等[5]的方法并略做修改，先加入0．1IIll含不同浓度的抑制剂于比色杯中，再加进2．8 rnl预先在30℃恒温水浴保温的底物溶液，然后加人0．1 ml酪氨酸酶水溶液，即刻充分混匀，在30℃恒温条件下，测定波长475 nm处的光密度值，由其随时间的增长直线的斜率计算出酶的活力，酶抑制实验平行做三次。测定单酚酶活力所用的底物为2mmol／L Tyr，酶的终浓度为40“g／ml；双酚酶所用底物为0．5 mmol／L L-DOPA，酶的终浓度为8斗g／ml。效应物对酶的抑制作用的机理是通过LineweaverBurk双倒数作图，比较酶催化反应的动力学参数，包括表观米氏常数(Km)和最大反应速度(Vm)的变化来判断的。
2．3 统计学处理采用Excel均数标准差进行统计学处理。
3 结果
3．1 各萃取部分对酪氨酸酶单酚酶活力的影响
以L-Tyr为底物，测试各部分对酪氨酸酶单酚酶活力的影响，结果见表1。实验中醇提取物及其石油醚、水溶部分IC50均超过150斗g／ml，而乙酸乙酯、正丁醇部分lC50分别为57．8、140 pg／ml，提示乙酸乙酯、正丁醇部分富集了西藏红缨合耳菊抑制酪氨酸酶单酚酶的主要有效组分。酪氨酸酶催化酪氨酸羟基化过程见图1、2。酪氨酸酶单酚酶的催化特征是有迟滞过程，随着抑制剂浓度的增大酪氨酸酶的稳态活力(直线部分的斜率)逐渐下降，并使迟滞时间延长。82．8斗g／“乙酸乙酯部分使得酶的稳态活力下降了82．1％(图3线1)、使迟滞时间从78 S延长到223 S(图3线2)；170．8阻s／ml正丁醇部分使得酶的稳态活力下降了69．4％(图4线1)、使迟滞时间从78 S延长到173 s(图4线2)。
3．2 各萃取部分对酪氨酸酶双酚酶活力的影响
以L-DOPA为底物，测试各部分对酪氨酸酶双酚酶活力的影响，结果如表2所示，实验中138 v．g／ml醇提取物、乙酸乙酯、正丁醇部分对酪氨酸酶抑制率分别为72．38％、80．95％、79．48％，均超过8．0 mg／ml熊果苷的70．2l％，而石油醚及水溶部分对酶的抑制活性较弱，说明西藏红缨合耳菊抑制酪氨酸酶双酚酶的主要有效组分集中在乙酸乙酯、正丁醇部分。乙酸乙酯、正丁醇部分对酪氨酸酶双酚酶活力测试结果如图5、图6所示，抑制率随着效应物浓度的增大而增大，IC∞分别为41．2、59．6斗e,／nd。相比熊果苷抑制双酚酶活性的IC如值1．44 mg／ml，抑制效果分别是熊果苷的35、24倍。
3．3 乙酸乙酯、正丁醇部分对酪氨酸酶抑制类型
进一步研究乙酸乙酯、正丁醇部分对酪氨酸酶双酚酶抑制作用类型，在测活体系中，固定酶的浓度，改变底物L．DOPA的浓度，测定不同浓度效应物对酶活力的影响，以Lineweaver—Burk双倒数作图判断抑制类型。乙酸乙酯部分双倒数图(见图7)得到一组纵轴截距不变的直线，表明其抑制类型为竞争性类型。以不同浓度乙酸乙酯部分测定的Km对抑制剂浓度作图(图7内插图)为一条直线，从直线的斜率求得抑制常数(Ki)为19．7斗g／ml。正丁醇部分双倒数图(见图8)得到一组横轴截距不变的直线，表明其抑制类型为非竞争性类型。以不同浓度正丁醇部分测定的1／Vmax对抑制剂浓度作图(图8内插图)为一条直线，从直线的斜率求得抑制常数(Ⅺ)为60．7ug／ml。
4 讨论
红缨合耳菊是西藏特有的植物，具有美白皮肤的功效，通过对其醇提物的研究发现其乙酸乙酯及正丁醇萃取部分对酪氨酸酶的活性有较强的抑制作用，乙酸乙酯萃取部分对单酚酶和双酚酶的抑制率达到50％的浓度(‘IC50)分别为57．8、41．2ug/ml，对双酚酶的抑制作用表现为可逆竞争性抑制类型，抑制常数Ⅺ为19．7ug/ml；正丁醇部分单酚酶和双酚酶的IC50分别为140、59．6ug/ml，抑制作用为可逆非竞争性抑制类型，Ki为60．7ug/ml。这两部分对酪氨酸酶的抑制效果远优于熊果苷，抑制效果分别是熊果苷的35、24倍，是一种有市场潜力的酪氨酸酶抑制剂，为红缨合耳菊的综合开发利用提供了一个新的方向及一定的实验依据，提示其在化妆品行业和临床医学应用方面具有新的开发价值。
参考文献
[1 ] Gong S Z, Chen G J, Yang Z R, Inhibitory effect of ferulic acid on oxidation of L-DOPA catalyzed bymushroom tyrosinase. Chin Jo f Chem Eng,2005(6):771-775.
[2]陈清西,宋康康.酪氨酸酶的研究进展，厦门大学学报(自然科学版),2006,45(5):731-737
[3]徐学涛,张焜,杜志云,等.天然产物对酪氨酸酶抑制作用的研究进展，广东化工,2007,34(11):53-56.
[4]Ryu, Y. B.,Westwood, I. M.et al. Kurarinol, tyrosinase inhibitor isolated from the root of Sophora favescens. Phytomedicine,2007,(9):22.[5?邓湘庆,龚盛昭,揭向阳.川芎提取物抑制酪氨酸酶活性的研究。中药材,2007,30(4):469-471.
[5]邓湘庆,龚盛昭,揭向阳.川芎提取物抑制酪氨酸酶活性的研究。中药材,2007,30(4):469-471.
本文献摘自中药材第31卷第10期2008年10月，不代表本网站赞同其观点和对其真实性负责，我们主要用于阅读分享，非商业用途，如若侵权，请告知删除。
