文题释义： 脂肪干细胞条件培养基：含有大量脂肪干细胞分泌的生物活性物质，可通过局部或全身给药的方式应用于创伤修复，且脂肪干细胞条件 培养基中细胞因子的种类和浓度具有可调控性，因此具有更广阔的应用前景。 脂肪干细胞外泌体：是脂肪干细胞分泌的细胞外囊泡的一种，其中携带大量由脂肪干细胞分泌的生物活性物质，如蛋白质、DNA、RNA和 脂质分子，可透过机体组织的生理屏障，参与细胞间的物质交换和信息沟通。

摘要

背景：脂肪干细胞无细胞提取液包括脂肪干细胞条件培养基、脂肪干细胞外泌体，因其不含细胞，易于携带、储存和运输，已成为当前 最热门的治疗方法之一。 目的：对脂肪干细胞无细胞提取液治疗用途的研究进展作一综述。 方法：以“脂肪干细胞、基质细胞与条件培养基”“脂肪干细胞、基质细胞与外泌体”为中文检索词，“adipose stem cell，adipose stromal cell and conditioned medium”和 “adipose stem cell，adipose stromal cell and exosomes”为英文检索词，由第一作者检索2005年1 月至2020年3月CNKI、万方、PubMed数据库相关文章。排除重复性及缺乏原创性的文献，计算机初检得到123篇文献，最终保留 62 篇进行 归纳总结。 结果与结论：脂肪干细胞无细胞提取液在皮肤老化、创面愈合、瘢痕恢复、神经再生等多个领域具有广泛的治疗潜力，但具体作用机制 尚不十分清楚，仍需进行更深入的相关研究。 关键词：干细胞；脂肪干细胞；提取液；条件培养基；外泌体；治疗；综述

0 引言 Introduction

脂肪组织由基质血管片段、成熟脂肪细胞和细胞外基质 构成。基质血管片段包括脂肪干细胞、脂肪前体细胞、内皮 细胞、巨噬细胞等。自体脂肪移植不仅能发挥填充的功效， 且脂肪组织中的脂肪干细胞具有再生潜力，可促进角质形成 细胞和成纤维细胞的迁移、增殖和分泌胶原。此外，脂肪组 织还能分泌脂联素、瘦素等，影响机体的内分泌系统。因此， 当前脂肪移植不仅在整形美容领域应用广泛，在修复重建和 内分泌领域的重要性也日益受到关注。脂肪干细胞是一种来 源于脂肪组织的间充质干细胞，具有自我更新和多向分化潜力，且来源广泛、含量丰富，被认为是一种具有临床应用 前景的成体干细胞，已广泛应用于组织工程和再生医学研究。 然而，脂肪干细胞移植可能存在致瘤性风险，其生物安全性仍然需要进一步研究。近年的研究显示旁分泌大量细胞因 子、外泌体等活性物质是脂肪干细胞发挥生物学效应的主要途径。

当前，脂肪干细胞无细胞提取液主要包括脂肪干细胞条 件培养基和脂肪干细胞外泌体。脂肪干细胞条件培养基含有 脂肪干细胞分泌的细胞因子、外囊泡、外泌体、DNA、RNA 等活性物质，具有促进组织修复、调节免疫等功能。脂肪干 细胞外泌体是细胞外囊泡的一种，携带丰富的蛋白质以及 RNA、DNA 和脂质分子，可透过机体组织的生理屏障，参与 细胞间的物质交换和信息沟通 [4]。脂肪干细胞无细胞提取液 不含细胞，不存在潜在致瘤风险，且易于携带、运输和储存， 更有异体移植等优势，在抗皮肤老化、创面修复、瘢痕修复、 神经再生等疾病治疗中具有广泛的应用潜力。新近对于脂肪 干细胞无细胞提取液的研究非常热门，其被认为是脂肪干细 胞疗法的可替代治疗方法。因此，文章就脂肪干细胞无细胞 提取液的制备和治疗用途作一综述。

1 资料和方法 Data and methods

1.1 资料来源 以“脂肪干细胞、基质细胞与条件培养基”“脂 肪干细胞、基质细胞与外泌体”为中文检索词，“adipose stem cell，adipose stromal cell and conditioned medium” 和“adipose stem cell，adipose stromal cell and exosomes” 为英文检索词，由第一作者检索 2005 年 1 月至 2020 年 3 月 PubMed 数据库以及中国知网、万方数据库相关文章。

1.2 入选标准

纳入标准：涉及脂肪干细胞无细胞提取液的相关文章。

排除标准：与研究内容无关的文章。

1.3 质量评估 通过检索数据库获得相关文献 123 篇，阅读摘要进行初筛，排除与研究内容不相关的、陈旧的文章，按照纳入标准，最后选择62篇文献进行综述。

2 结果 Results

2.1 脂肪干细胞条件培养基

2.1.1 脂肪干细胞条件培养基的制备 将脂肪干细胞添加到 含体积分数为 10% 胎牛血清的基础培养基中培养一段时间， 待细胞生长状态良好后将基础培养基替换成无血清培养基， 培养两三天后收集上清液，即为脂肪干细胞条件培养基。体 外培养的条件不同，脂肪干细胞条件培养基中含有的细胞因 子的量也不同。多项研究在正常氧含量 ( 体积分数为 20%- 21%) 的体外培养条件下获取脂肪干细胞条件培养基，也有研 究报道在低氧条件 ( 体积分数为 2%O2) 下可获取含有更多细 胞因子的脂肪干细胞条件培养基，可能原因是脂肪干细胞在 低氧条件下激活低氧诱导因子 1α，介导其下游的各类信号 通路，继而刺激脂肪干细胞增殖，促使脂肪干细胞分泌更 多的血管内皮生长因子、肝细胞生长因子和碱性成纤维细胞生长因子等。此外，研究报道在三维培养条件下获取的 脂肪干细胞条件培养基中含有更多的转化生长因子 β 和血管 内皮生长因子，这可能与三维培养更能模拟脂肪干细胞的体内环境有关。低氧联合三维培养可能是获取脂肪干细胞 条件培养基较好的体外培养条件。

2.1.2 脂肪干细胞条件培养基与皮肤老化 皮肤老化可分为 内源性老化和外源性老化。内源性老化是人体的一个自然老 化过程，主要由于成纤维细胞受损、减少，逐渐丧失其增殖 及合成胶原的能力，从而出现皱纹、细纹、色素沉着、皮 肤弹性减退等表现。体外研究发现，脂肪干细胞条件培养基 中的旁分泌因子如表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、 转化生长因子 β、血管内皮生长因子等通过促进皮肤成纤维 细胞增殖、迁移，增加细胞外基质和胶原合成，从而改善皱 纹及面部凹陷。研究还发现脂肪干细胞条件培养基可恢复 体外连续传代后衰老的成纤维细胞的生物学活性，包括促进 增殖和分泌细胞外基质蛋白 ( Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原以及弹性 蛋白)。此外，张坤等通过 D- 半乳糖制备小鼠皮肤 成纤维细胞体外衰老模型，添加脂肪干细胞条件培养基后可 降低小鼠皮肤成纤维细胞中 caspase3、p53 的表达，从而降 低衰老相关标志物 β- 半乳糖苷酶的活性。对体内研究而言， 脂肪干细胞条件培养基治疗需克服机体的皮肤屏障。众所周知，位于表皮最外层的角质层是抵御外界环境损伤、防止水分丢失的主要结构，也是各种化妆品和大分子药物不能渗透进入真皮的原因，因此，临床上常使用激光和微针制造微型孔道以增加药物吸收。研究发现，脂肪干细胞条件培养基联 合点阵 CO2 激光治疗不仅可以提高皮肤弹性，改善皮肤粗糙 度以及降低经皮水分丢失等皮肤老化现象，还可减轻激光后 色素沉着。还有研究报道微针联合脂肪干细胞条件培养基 可显著改善皮肤粗糙度，降低黑色素含量，提高皮肤亮度、 光泽、弹性和抗皱等多种功效。研究表明，脂肪干细胞条 件培养基中的各种细胞因子通过产生的微孔进到真皮，从而 激活成纤维细胞，刺激胶原的生成和重塑，促进皮肤再生。

紫外线是引起皮肤外源性老化的重要因素，也称为光老化。紫外线 (290-320 nm) 通过产生活性氧上调基质金 属蛋白酶的表达和促炎症细胞因子的分泌，诱导真皮中的成 纤维细胞损伤，进而使细胞外基质生成减少。SON 等研究发现脂肪干细胞条件培养基与紫外线照射的人真皮成纤 维细胞共培养可显著上调Ⅰ型前胶原的表达，下调基质金属 蛋白酶 1 的表达。此外，GUO 等探讨脂肪干细胞条件培 养基对紫外线照射后不同衰老程度成纤维细胞的保护作用， 结果表明脂肪干细胞条件培养基预处理显著降低了成纤维细 胞的衰老率。LI 等 研究表明脂肪干细胞条件培养基通过 下调紫外线 B 诱导的 MAPK 和 TGF-β/Smad 信号通路减少基 质金属蛋白酶 1 的产生和白细胞介素 6 的分泌，从而保护人角质形成细胞及人皮肤成纤维细胞免受紫外线 B 诱导的光老化。

上述研究表明，无论是内源性还是外源性老化，脂肪干 细胞条件培养基均能改善成纤维细胞的功能，促使其合成更 多的细胞外基质，其机制可能与脂肪干细胞条件培养基中含 有的生长因子有关。

2.1.3 脂肪干细胞条件培养基与创面愈合 创面愈合是一个非常复杂的过程，涉及浸润细胞、驻扎细胞和细胞因子的相互作用，角质形成细胞、内皮细胞、成纤维细胞的迁移、增 殖及细胞外基质的沉积是创面愈合的主要生物学过程。近年来，已有证据表明脂肪干细胞条件培养基对创面愈合起重要作用。COOPER等 研究发现脂肪干细胞条件培养基能促 进成纤维细胞的增殖及迁移，在随后的大鼠缺血创面模型中 发现脂肪干细胞条件培养基可加速成年大鼠缺血性创面的愈 合。SEO 等 研究发现脂肪干细胞条件培养基联合 Exendin-4 (Ex-4) 可促进糖尿病鼠创面愈合，两者具有协同作用，可能 机制是 Ex-4 作为一种胰高血糖素样肽受体激动剂，促进胰岛 素分泌，降低血糖，联合脂肪干细胞条件培养基后可显著促 进人脐静脉内皮细胞的增殖及迁移进而促进血管生成。此外， 脂肪干细胞条件培养基可联合富血小板纤维蛋白加速创面愈 合。富血小板纤维蛋白中含有多种生长因子和基质蛋白，同样具有促进组织再生和修复的功能，两者联合后更能刺激成 纤维细胞分泌细胞外基质，肉芽组织形成更多，从而更好地促进创面愈合。ZHAO 等进一步探讨了富血小板纤维蛋白中哪些细胞因子对皮肤成纤维细胞增殖和迁移发挥影响，结果表明：表皮生长因子、血小板源性生长因子 AA、血管 内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子这 4 种细胞因子浓度较高，其中碱性成纤维细胞生长因子是促进成纤维细胞增 殖和迁移的主要细胞因子，血管内皮生长因子和血小板源性生长因子 AA 主要对成纤维细胞的迁移起促进作用。此外，与单一细胞因子相比，脂肪干细胞条件培养基对成纤维细胞 增殖和迁移的促进作用更为明显。这些结果表明，脂肪干细 胞条件培养基中的众多因子具有协同作用，共同促进创面愈合。

2.1.4 脂肪干细胞条件培养基与瘢痕 瘢痕分为病理性瘢 痕和生理性瘢痕，病理性瘢痕主要指瘢痕疙瘩和增生性瘢痕。文献报道脂肪干细胞条件培养基可抑制瘢痕疙瘩形成。 WANG 等将瘢痕疙瘩组织与脂肪干细胞条件培养基体外 共培养，能显著降低瘢痕疙瘩组织中金属蛋白酶组织抑制因 子 1 水平，减少Ⅰ型胶原的沉积，表明脂肪干细胞条件培养 基通过调节胞外基质的重塑与胶原合成，从而改善瘢痕疙瘩的形成。

增生性瘢痕通常以细胞外基质异常沉积为特征，而转 化生长因子 β1 因其强烈的致纤维化作用被认为是瘢痕纤维 化修复过程中的关键因子。宋菲等在转化生长因子 β1 的 刺激下研究了不同浓度脂肪干细胞条件培养基 (0，10%， 50%，100%) 对成纤维细胞增殖及凋亡的影响，结果发现脂 肪干细胞条件培养基浓度越高，抑制增殖及促进凋亡作用越 明显。MA 等研究发现脂肪干细胞条件培养基中的肝细胞 生长因子可有效抑制纤维化并调节细胞外基质重塑。此外， P38/MAPK 信号通路在增生性瘢痕纤维化中也起重要作用， LI 等研究了脂肪干细胞条件培养基通过抑制 p38/MAPK 信 号通路治疗增生性瘢痕的机制，发现经脂肪干细胞条件培养 基处理的增生性瘢痕成纤维细胞 p-p38 蛋白水平呈浓度依赖 性下调，其抑制剂 SB203580 的应用进一步降低了 p-p38 的 表达，而 p38 的激活剂茴香霉素通过上调 p-p38 的表达，促 进胶原的生成和沉积。因此，该研究显示脂肪干细胞条件培 养基可通过抑制 p38/MAPK 信号通路达到抗瘢痕作用。另外，ZHANG 等在兔耳增生性瘢痕模型注射脂肪干细胞条件 培养基后，发现兔耳增生性瘢痕变得不明显，组织学分析显 示经脂肪干细胞条件培养基处理的一侧瘢痕更扁平、更薄， 其胶原纤维排列规则，胶原沉积减少。综上所述，脂肪干细 胞条件培养基通过减少胶原沉积及抗纤维化在减轻瘢痕形成 中具有重要作用，推测可能与培养基中含有的细胞因子有关， 但具体机制尚不明确，仍需进行更深入的研究。

2.1.5 脂肪干细胞条件培养基与神经保护 脂肪干细胞条件 培养基局部移植可营养神经。新生儿缺氧缺血性脑病是引起 新生儿急性死亡和慢性神经系统损伤的主要原因之一，具有 相当高的发病率和死亡率。WEI 等在大鼠脑缺氧缺血性损 伤模型中测试了脂肪干细胞条件培养基保护神经元的能力。 结果表明脂肪干细胞条件培养基中含有的神经营养因子如胰 岛素样生长因子 1 和脑源性神经营养因子，对神经病变损伤 的恢复起着重要作用，改善了缺氧缺血性脑损伤大鼠模型的 认知功能和运动功能。SALGADO 等分析了在各种微环境 下脂肪干细胞分泌的可溶性因子，发现脂肪干细胞可分泌神 经生长因子、胶质源性神经营养因子及脑源性神经营养因子 等与神经再生密切相关的生长因子，这些神经再生相关的生 长因子可能是脂肪干细胞条件培养基促进神经损伤修复的根本原因。

2.1.6 脂肪干细胞条件培养基与呼吸系统 呼吸系统是脂肪干细胞条件培养基应用的另一领域。急性呼吸窘迫综合征 是临床上急危重症患者死亡的重要原因。研究表明，脂肪 干细胞条件培养基中的旁分泌因子能有效减轻急性呼吸窘迫综合征肺损伤的发展，在脂多糖诱导的小鼠急性呼吸窘 迫综合征模型中发现使用脂肪干细胞条件培养基可改善肺 部炎症组织学变化、抑制支气管肺泡灌洗液蛋白外渗、减少炎症递质肿瘤坏死因子和白细胞介素 6 的分泌。此外， 肺动脉高压和肺纤维化也是呼吸系统的难治愈性疾病，现 有的药物干预措施未能改善其临床结果或降低疾病相关死亡率，故而 RATHINASABAPATHY 等研究了脂肪干细胞条 件培养基对肺动脉高压和肺纤维的影响，结果表明：在用 野百合碱和博莱霉素诱导的大鼠肺动脉高压和肺纤维化模型中，脂肪干细胞条件培养基通过改善肺血流量和抑制心 脏重塑减轻野百合碱诱导的肺动脉高压，以及通过减轻胶 原沉积阻止博莱霉素模型肺纤维化的进展，从而改善肺动 脉高压和肺纤维化的临床症状，可能为肺动脉高压和肺纤 维化的临床治疗提供一种新的方法，但其具体机制仍需进 一步的研究。

2.2 脂肪干细胞外泌体

2.2.1 脂肪干细胞外泌体的制备 外泌体是由多泡体分泌的 直径为30-150 nm 不等的膜囊泡，属于胞外囊泡的一种。 当前，制备外泌体的方法较多，包括基于外泌体大小和密度 的蔗糖梯度离心法，基于不同膜孔径分离的超滤法， 以及基于表面标志物的表达吸附、分离的免疫亲和磁珠分离法，还有根据聚合物共沉淀原理的 ExoQuick 提取法， 其中最常用的是基于外泌体大小的超速离心法，即先进 行脂肪干细胞体外培养，将达到 70%-80% 融合的脂肪干细 胞用 PBS 冲洗，接种到无血清培养基中培养 48 h 后在 4 ℃ 下收集上清液，分别进行 300×g 离心 10 min，2 000×g 离心 10 min，10 000×g 离心 30 min 以去除细胞和细胞碎片；继 续将培养基 100 000×g 超速离心 70 min，将离心管底部的 沉淀物重新悬浮于 PBS 中并冲洗，最后进行 100 000×g 离心 70 min 去除外泌体中污染的蛋白质，最终获得外泌体颗粒。

2.2.2 脂肪干细胞外泌体与创面愈合 研究表明脂肪干细胞 外泌体通过促进成纤维细胞迁移、增殖而促进创面愈合。HU 等研究报道外泌体能被成纤维细胞内化，增加 N-cadherin、 cyclin-1、PCNA 和Ⅰ型胶原的基因表达，同时促进成纤维细 胞的增殖和迁移；有趣的是，与局部注射相比，静脉注射脂 肪干细胞外泌体促进创面愈合效果更好。ZHANG 等研究 发现脂肪干细胞外泌体主要通过激活 PI3K/Akt 信号途径，刺激真皮成纤维细胞增殖及迁移，从而促进创面愈合。脂肪干 细胞外泌体不仅影响成纤维细胞，还可影响角质形成细胞。受损人角质形成细胞与脂肪干细胞外泌体共培养后，可显著 恢复受损人角质形成细胞的迁移能力。田新立等研究 发现脂肪干细胞外泌体与角质形成细胞共培养后 ERK1/2、 AKT 和 STAT3 的磷酸化水平显著增高，说明外泌体可能通过 激活 ERK1/2、AKT 和 STAT3 信号通路进而影响其增殖及迁移。 此外，MA 等将人角质形成细胞置于过氧化氢建立皮肤损 伤模型，发现脂肪干细胞外泌体也可通过激活 Wnt/β‐catenin 信号通路从而促进其增殖和迁移并抑制凋亡。还有研究报道 高表达 micoRNA-21 的脂肪干细胞外泌体通过增强基质金属 蛋白酶 9 和抑制基质金属蛋白酶抑制剂 2 的表达从而促进角 质形成细胞的增殖和迁移。此外，脂肪干细胞外泌体还可 影响内皮细胞。张静等研究发现脂肪干细胞外泌体可通 过促进人脐静脉内皮细胞增殖和迁移从而促进血管新生。过 表达 Nrf2 的脂肪干细胞外泌体可促进血管内皮祖细胞增殖、 降低炎症蛋白的表达，从而促进糖尿病大鼠足部创面愈合。此外，作为外泌体固定剂和伤口敷料的透明质酸与外泌体联 合治疗更能促进小鼠皮肤创面愈合，组织学染色结果显示脂 肪干细胞外泌体 + 透明质酸联合组可见完整的皮肤全层再生 和更显著的血管新生。因此，脂肪干细胞外泌体可影响创 面修复的主要功能细胞，包括成纤维细胞、角质形成细胞和 血管内皮细胞等，从而加速创面愈合，机制可能在于脂肪干 细胞外泌体中含有的活性 RNA 物质。

2.2.3 脂肪干细胞外泌体与心肌保护 尽快恢复缺血心肌的 血流灌注是急性心肌梗死的有效治疗方法，但缺血再灌注可 能会引起氧化应激和炎症反应，导致心肌细胞进一步损伤和 凋亡。近年来，越来越多的研究证明来自不同干细胞的外 泌体可保护心肌细胞，增强心肌功能。LIU 等研究报 道了脂肪干细胞外泌体对心肌细胞缺血再灌注损伤的治疗 效果。研究发现，脂肪干细胞外泌体不仅能被小鼠心肌细胞 摄取，而且能明显抑制过氧化氢诱导的小鼠心肌细胞凋亡， 说明外泌体能保护小鼠心肌细胞免受氧化应激所致的细胞凋亡。此外，CUI 等体外研究发现脂肪干细胞外泌体通过 激活 Wnt/β‐catenin 信号通路具有心肌保护作用；在小鼠缺 血再灌注损伤模型中，脂肪干细胞外泌体治疗可显著减少小鼠心肌梗死面积，且血清 CK-MB、LDH 和 cTnI 水平以及 Caspase 3 活化显著降低；在大鼠急性心肌梗死模型中，富含 miR-146a 的外泌体组通过抑制早期生长反应因子的表达更能 有效抑制心肌细胞凋亡、降低炎症反应水平及减轻心肌纤维化。综上所述，脂肪干细胞外泌体通过抑制心肌细胞凋亡 具有明显的心肌保护作用，而含有miRNA 的外泌体增强了此种作用。

2.2.4 脂肪干细胞外泌体与特应性皮炎 特应性皮炎又名特 应性湿疹，以血清 IgE 升高及外周血嗜酸性粒细胞增多为特点，常表现为皮肤干燥、湿疹样皮疹、剧烈瘙痒。最近有研 究证实了脂肪干细胞外泌体可通过调节炎症及炎性细胞因子 的表达从而改善特应性皮炎的发生发展。在该研究中，脂肪 干细胞外泌体被应用于含尘螨抗原的 Biostir®-AD 霜诱导的小 鼠特应性皮炎模型，发现与口服强的松相比，连续 4 周每周 注射脂肪干细胞外泌体 3 次可显著减轻特应性皮炎的症状， 进一步研究发现脂肪干细胞外泌体注射后显著减少了皮损中 炎性细胞如 CD86+ 和 CD206+ 的数量以及血清 IgE 介导的嗜 酸性粒细胞水平，并以剂量依赖性的方式降低皮损中白细胞 介素 4、白细胞介素 23、白细胞介素 31 和肿瘤坏死因子 α mRNA 水平。

3 总结与展望 Summary and prospects

综上所述，脂肪干细胞无细胞提取液克服了脂肪干细胞 临床应用的局限性，其不含细胞，免疫原性低，无潜在致瘤 性风险，可异体移植，且易于携带、转运和保存，便于商业 推广等；局部移植可促进细胞增殖及迁移、促血管生成、抑 制细胞凋亡、抑制炎症反应、减少氧化应激、免疫调节等功 能，从而促进组织再生和修复，已广泛应用于抗老化、 创面愈合、瘢痕修复及神经再生等领域，具有广阔的临床应 用前景。然而，当前获取脂肪干细胞条件培养基和脂肪干细 胞外泌体仍需要进行细胞分离和体外培养，可能存在生物学 污染的风险；且外泌体的制备步骤繁琐、耗时，这些都需要 进一步的改进。通过纯物理方法获取的富含细胞因子和细胞 外囊泡的脂肪组织萃取液无需进行细胞分离和体外培养，在 手术室或简单实验室即可快速制备，显著降低了生物学污染 的风险，因此与脂肪干细胞条件培养基和脂肪干细胞外泌体 相比，脂肪组织萃取液可能更容易在临床推广应用。此外，脂肪来源干细胞基质胶是一种通过纯物理方法获取的高度浓缩、结构相对完整的天然细胞外基质和脂肪干细胞的脂肪浓缩产物，其来源的基质胶条件培养基也是近年研究的热点。研究显示相对于脂肪组织和基质血管片段细胞来源的条件培养基，基质胶条件培养基既不需要异种胶原酶消化， 也无需进行体外扩增，降低了生物学污染的风险，且其对角质形成细胞及成纤维细胞增殖及迁移的促进作用更 显著，促进创面愈合的效果更好，其可能机制是脂肪干 细胞在天然的细胞外基质保护下分泌更多高浓度的细胞因子。同时，基质胶条件培养基和脂肪组织萃取液中可能也含 有高浓度的脂肪干细胞外泌体。因此，基质胶条件培养基和 脂肪组织萃取液是脂肪干细胞无细胞提取液的补充，或许是脂肪干细胞外泌体新的来源，有望在组织修复和再生医学中广泛应用。